實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）指的是在PCR進(jìn)行的同時(shí)，對其過(guò)程進(jìn)行監測的能力（即實(shí)時(shí)）。因此，數據可在PCR擴增過(guò)程中，而非PCR結束之后，進(jìn)行收集。這為基于PCR的DNA和RNA定量方法帶來(lái)了革命性的變革。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qPCR)中，反應以循環(huán)中檢測到目標擴增的時(shí)間點(diǎn)為特征，而非在一定循環(huán)數后目標分子累計的擴增量。目標核酸的起始拷貝數越高，則會(huì )越快觀(guān)察到熒光的顯著(zhù)增加。相反，終點(diǎn)法檢測（也稱(chēng) “讀板檢測”）測量的是PCR循環(huán)結束時(shí)累計的PCR產(chǎn)物量。
概述
我們開(kāi)發(fā)了兩種通過(guò)使用序列檢測系統（SDS）儀器進(jìn)行PCR產(chǎn)物檢測的試劑：
TaqMan方法
TaqMan方法通過(guò)采用熒光探針在PCR循環(huán)過(guò)程中隨著(zhù)特定PCR產(chǎn)物的累計而對其進(jìn)行檢測。
使用TaqMan方法的檢測類(lèi)型
TaqMan方法可用于以下檢測類(lèi)型：
定量，包括：
SYBR Green I染料試劑
SYBR Green I染料法采用了Applied Biosystems™ SYBR™ Green I染料，一種可以在PCR循環(huán)過(guò)程中隨著(zhù)PCR產(chǎn)物的累計而對其進(jìn)行檢測的高度特異性雙鏈DNA結合染料。TaqMan和SYBR Green I染料法為重要的區別在于SYBR Green I染料試劑可以檢測所有雙鏈DNA，包括非特異性的反應產(chǎn)物。因此這樣經(jīng)過(guò)特別優(yōu)化的反應體系，對于獲取準確的結果而言是非常必要的。
使用SYBR Green I染料法的檢測類(lèi)型
SYBR Green I染料法可用于以下檢測類(lèi)型：
TaqMan試劑
背景
初，使用嵌入式染料進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR (qPCR) 產(chǎn)物定量。但這些染料存在重大缺點(diǎn)，即會(huì )同時(shí)檢測特異性以及非特異性PCR產(chǎn)物的擴增量。
TaqMan方法的開(kāi)發(fā)
通過(guò)引入基于Taq DNA聚合酶5’核酸酶活性的熒光標記探針，實(shí)時(shí)定量PCR系統得到了顯著(zhù)提升。這些熒光探針的使用，使得實(shí)時(shí)定量的方法得到了發(fā)展，實(shí)現了僅對特定擴增產(chǎn)物的檢測。此外，熒光標記探針的開(kāi)發(fā)，也免去了用于探針降解分析的PCR反應后處理過(guò)程。
TaqMan序列檢測方法的工作原理
TaqMan試劑通過(guò)采用熒光探針在PCR循環(huán)過(guò)程中隨著(zhù)特定PCR產(chǎn)物的累計而對其進(jìn)行檢測。工作原理：
步驟、過(guò)程
兩種類(lèi)型的 TaqMan 探針
我們可提供兩種類(lèi)型的Applied Biosystems™ TaqMan® 探針：
推薦用于等位基因檢測的 TaqMan MGB 探針
我們一般推薦使用TaqMan MGB探針進(jìn)行等位基因分型分析，特別是當傳統TaqMan探針超過(guò)30個(gè)核苷酸時(shí)。TaqMan MGB探針包含：
終，TaqMan MGB 探針會(huì )在匹配和未匹配探針之間展現出更大的 Tm 值差異，從而提供更準確的等位基因分型。
TaqMan 方法的優(yōu)點(diǎn)
TaqMan方法的優(yōu)點(diǎn)如下：
TaqMan方法的缺點(diǎn)：
TaqMan方法的主要缺點(diǎn)在于需要根據不同的序列，合成不同的探針。
背景
一般將可與雙鏈DNA發(fā)生結合的小分子分為以下兩類(lèi)：
無(wú)論哪種結合方法，用于PCR實(shí)時(shí)檢測的DNA結合染料都需要滿(mǎn)足以下兩個(gè)條件：
我們開(kāi)發(fā)更加優(yōu)化的條件，使得SYBR Green I染料的使用不會(huì )對PCR產(chǎn)生抑制并帶來(lái)相對于溴化乙錠更為靈敏的檢測。
SYBR Green I染料法的工作原理
SYBR Green I染料法通過(guò)SYBR Green I染料與PCR過(guò)程中產(chǎn)生的雙鏈DNA結合，而對聚合酶鏈反應（PCR）的產(chǎn)物進(jìn)行檢測。工作原理：
步驟、過(guò)程
當SYBR Green I染料被加入到樣品中后，它可立即與樣品中的雙鏈DNA進(jìn)行結合 。
SYBR Green I染料法的優(yōu)點(diǎn)
SYBR Green I染料法的優(yōu)點(diǎn)如下：
SYBR Green I染料法的缺點(diǎn)：
SYBR Green I染料法的大缺點(diǎn)在于可能會(huì )產(chǎn)生假陽(yáng)性信號；即，因為SYBR Green I染料可與任何的雙鏈DNA發(fā)生結合，因此也會(huì )與非特異性的雙鏈DNA序列發(fā)生結合。
其他注意事項
采用DNA結合染料的另一原因，是多重染料與單一擴增分子的結合。這可提高擴增產(chǎn)物檢測的靈敏度?；诙嘀厝玖系慕Y合，將迎來(lái)信號量取決于在反應中所產(chǎn)生的雙鏈DNA量的局面。因此，如果擴增效率相同，相較于對較短產(chǎn)物的擴增，對較長(cháng)產(chǎn)物的擴增將會(huì )產(chǎn)生更多的信號。這*不同于熒光探針，使用熒光探針時(shí)，對于每個(gè)合成的擴增分子淬滅僅釋放一個(gè)熒光基團，與其長(cháng)短并不相關(guān)。
什么是定量檢測？
定量檢測是一種實(shí)時(shí)的PCR (qPCR) 檢測。測量（定量）每輪PCR擴增循環(huán)中，檢測目標核酸片段的量。目標分子可以為DNA、cDNA或RNA。此方法指南主要對以下三種定量檢測進(jìn)行討論：
定量分析常見(jiàn)術(shù)語(yǔ)
擴增子：PCR過(guò)程而產(chǎn)生的DNA短片段
擴增曲線(xiàn)：根據熒光信號相對于循環(huán)數而制作的曲線(xiàn)
基線(xiàn)：PCR起始時(shí)，熒光信號還未發(fā)生變化的幾個(gè)循環(huán)
Ct（閾值循環(huán)）：熒光信號超過(guò)NTC（無(wú)模板對照樣品）固定閾值時(shí)的循環(huán)數 。用于對擴增質(zhì)量進(jìn)行驗證。
核酸目標：（也稱(chēng)為“目標模板”）——需要擴增的DNA或RNA序列
惰性參比染料： 一種可作為內部對照，以用于在數據分析時(shí)對報告基團染料信號進(jìn)行均一化的染料。均一化是對因濃度或體積變化而隨之引起波動(dòng)進(jìn)行的必要校正。所有的SDS PCR試劑盒都提供了參比熒光對照。
Rn（均一化報告基團）：報告基團染料釋放的熒光強度除以惰性參比染料釋放的熒光強度
Rn+: 一次反應的Rn值包含所有的組分，包括模板
Rn-：未反應樣品的Rn值。Rn值可通過(guò)以下方式獲?。?/p>
ΔRn (delta Rn): 在特定PCR條件設置下所產(chǎn)生的信號量級。
ΔRn可通過(guò)以下公式計算：(Rn+) – (Rn-)標準品 具有已知濃度的A樣本，用于繪制標準曲線(xiàn)。通過(guò)使用不同濃度的標準品，您可構建用于未知樣品定量分析的標準曲線(xiàn)。
閾值：早期PCR循環(huán)時(shí)Rn值的平均標準差，乘以相應的校正系數閾值應當設定在PCR指數擴增時(shí)的相關(guān)區域。
未知：具有未知模板量的樣品。即，您需要進(jìn)行檢測的樣品。
實(shí)時(shí)PCR (qPCR) 定量檢測工作原理
在PCR的起始循環(huán)中，熒光信號幾乎不發(fā)生變化。從而定義為擴增曲線(xiàn)中的基線(xiàn)。而超出基線(xiàn)部分的熒光的增加，則為對累計目標分子的檢測。固定的熒光閾值線(xiàn)，可設置在基線(xiàn)之上。熒光超過(guò)固定閾值時(shí)的循環(huán)數則為參數CT（閾值循環(huán)）。
概述
當對定量檢測的結果進(jìn)行計算時(shí)，可以采用或相對定量。
什么是定量？
定量檢測是根據標準曲線(xiàn)對未知樣品進(jìn)行的定量。
示例
定量可根據病毒的拷貝數，監控疾病狀態(tài)。研究者須知道特定生物學(xué)樣品中目標RNA分子的準確拷貝數，以對疾病的進(jìn)展進(jìn)行監測。定量可通過(guò)從所有SDS儀器獲取的數據進(jìn)行，但注意標準品的定量則須首先通過(guò)其他方法獲取。
什么是相對定量？
相對定量用于分析特定樣品相對于參照樣品（比如，未處理的對照組）某個(gè)基因表達量的變化。
示例
相對定量可用于檢測化合物（藥物）引起的基因表達改變。經(jīng)化學(xué)處理樣品中的特定目標基因的表達水平可與相對未處理樣品中的基因表達水平進(jìn)行比較。
相對定量的計算方法
相對定量可根據從所有SDS儀器獲取的數據而進(jìn)行。用于相對定量的計算方法有：
確定使用哪種方法 所有方法都可產(chǎn)生同等的結果。當在確定使用哪種方法時(shí)，需要注意：
常用術(shù)語(yǔ)
和相對定量中常用的術(shù)語(yǔ)，如下：
標準：用于構建標準曲線(xiàn)的已知濃度樣品。
參考文獻：用于對實(shí)驗結果進(jìn)行均一化的陰性或陽(yáng)性信號。內源性和外源性對照是常見(jiàn)的陽(yáng)性對照。陽(yáng)性對照指的是因 PCR擴增 而產(chǎn)生的信號。陽(yáng)性對照則具有自己的引物和探針組合。
內源性對照：指的是，在每個(gè)樣品進(jìn)行提取時(shí)便已存在于樣品中的RNA或DNA。當采用內源性對照作為陽(yáng)性對照時(shí)，您可通過(guò)對信使RNA（mRNA）的均一化定量來(lái)消除每次反應中加入的總RNA量的差異。
外源性對照：指的是，在每個(gè)樣品中加入的具有已知濃度的特殊RNA或DNA。外源性陽(yáng)性對照通常是來(lái)自可以作為內部陽(yáng)性對照（IPC）的體外成分，可區分真正的目標陰性和PCR抑制。此外，外源性對照還可均一化樣品提取或逆轉錄中互補DNA（cDNA）合成的效率差異。無(wú)論是否使用陽(yáng)性對照，使用含有ROX染料的參比熒光對照都是十分重要的，因為它可以對非PCR相關(guān)的熒光信號波動(dòng)進(jìn)行均一化。
目標分子的均一化量：一個(gè)可以用于比較不同樣品中目標分子相對量的無(wú)單位數字。
校準品：可以用作比較結果基礎的樣品。
概述
因采用的是相對于基礎樣品的表達量，例如校準品，用于相對定量的標準曲線(xiàn)一般都比較容易繪制。對于所有的實(shí)驗樣品，其目標分子的量均是從標準曲線(xiàn)獲取，然后除以校準品的目標分子量而確定的。因此，校準品便成為1 X 樣品，而所有其他的量則都為以n倍校準品來(lái)表示。例如，在研究藥物對表達產(chǎn)生的影響時(shí)，未處理的對照樣品便是合理恰當的校準品。
關(guān)鍵指南
以下指南可為相對定量中標準曲線(xiàn)的正確使用，提供關(guān)鍵指導：
內源性對照
對于內源性對照進(jìn)行擴增可用于對加入至反應的樣品RNA或DNA的量進(jìn)行標準化。對于基因表達定量，研究者采用過(guò) ß-肌動(dòng)蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、核糖體RNA（rRNA）或其他RNA作為內源性對照。
標準品
由于樣品量會(huì )除以校準品的量，則標準曲線(xiàn)中的單位便被去除了。因此，對于標準品來(lái)說(shuō)所有需要知道的只是它們的相對稀釋比。對于相對定量，任何含有合適目標分子的RNA或DNA儲存液都可用作標準品。
比較CT法與標準曲線(xiàn)法相似，只是它利用的是算術(shù)公式2−ΔΔCT來(lái)獲取相同的相對定量結果。
算術(shù)公式：
為了有效地利用比較 CT 法，目標分子（基因）和對照（內源性對照）的擴增效率應當近似相同。
更多關(guān)于使用比較CT法進(jìn)行相對定量的信息，請參閱用戶(hù)手冊#2：基因表達的相對定量（PN4303859）。
概述
用于定量的標準曲線(xiàn)法與用于相對定量的標準曲線(xiàn)法類(lèi)似，只是標準品的量必須首先通過(guò)其他獨立方法獲取。
關(guān)鍵指南
下面的指南對于定量中標準曲線(xiàn)的正確使用十分關(guān)鍵：
無(wú)法使用DNA作為RNA定量的標準品，因為對于逆轉錄過(guò)程的效率沒(méi)有對照。
標準品
標準品的量必須首先通過(guò)其他獨立的方法獲取。質(zhì)粒 DNA 和體外轉錄的 RNA 通常用于制備標準品。濃度可在A(yíng)260 處被測量得到，并通過(guò)使用DNA或RNA的分子量轉化成拷貝數。
